天然产物，浩如烟海。这是大自然对人类的原始馈赠，从古至今为人类提供资源和能量。
其中，萜类化合物是分布最广泛且种类最丰富的一类天然产物，涵盖了青蒿素、素、紫杉醇、胡萝卜素、人参皂苷等等。这类化合物具有抗炎、抗疟、抗肿瘤、降血压等多种生物活性，已在食品、日化、医疗等领域受到广泛关注。
合成萜类化合物的方式多种多样，包括植物提取法、化学合成法以及生物合成法。生物合成法是更为理想的策略，大体可分为两大类，一类是通过代谢工程手段直接在植物中促进萜类的合成；另一类是通过合成生物学方法在微生物等底盘细胞中合成目标产物。现阶段，合成生物学策略被视为植物源萜类生产的有效技术方法之一。
近日，来自麦吉尔大学生物工程系的研究人员发表了一篇综述论文，系统回顾了近 10 年来 (2012-2022) 酿酒酵母生产萜类化合物的进展。相关论文已发表在Natural Product Reports上。
在论文中，研究人员重点从 4 个方面讨论了在工程化酿酒酵母的突破，包括调控底盘细胞代谢，重新布线和重建代谢途径，生物合成酶的工程化催化活性、底物选择性和产物特异性，以及通过酶融合或亚细胞区隔化来定位萜类化合物的合成。
论文的通讯作者是加拿大麦吉尔大学生物工程系的助理教授Codruta Ignea，她的研究方向是在酿酒酵母等微生物底盘细胞中重建相应的生物合成途径，用来生产高价值化合物。
酿酒酵母是一类最简单的真核细胞，其与植物来源的萜类化合物生物合成酶适配性高，因此也成为基于代谢工程和合成生物学方法生产复杂萜类化合物使用最广泛的底盘细胞之一。
酵母通过甲羟戊酸途径（MVA）合成萜类化合物的前体化合物，包括异戊烯基焦磷酸（IPP）、二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）、香叶基焦磷酸（GPP）和法尼基焦磷酸（FPP）。该途径以乙酰辅酶A 为原料合成异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸的一条代谢途径，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。
为了进一步提升天然产物的产量和效率，科学家们正在通过多种工程化手段优化酿酒酵母。CRISPR/Cas9 系统是其中的一种重要手段，该技术彻底改变了基因组编辑，此前的研究已经证明该系统是在酵母染色体中整合相关基因的最佳方法之一。
▲图 基于合成生物学策略，采用工程化宿主细胞生产植物源化合物（来源：上述论文）
首先，通过 CRISPR/Cas9 靶向修改 MVA 途径的靶基因，提高产能和生产稳定性。该策略应用于檀香烯和檀香醇的生物合成，产出量分别达到了 164.7mg/L 和 68.8mg/L；另一种方法是通过 CRISPR 技术同时编辑多个位点，使得经优化的酿酒酵母生产 β-胡萝卜素、虾青素等。
其次，利用 CRISPR/Cas9 调节包括酵母在内的底盘细胞的转录调控，通过靶向相关基因的上游区域调节基因表达。研究表明，使用 CRISPRa/i 调节 MVA 途径和 β-胡萝卜素途径酶相关基因的表达水平与菌株最终产量的增加或减少直接相关。
第三种方式是组合策略。整合多种方法协同调节代谢路径，进一步调高系统性能。同时还提出高通量克隆方法，提升菌株的产量。近期，科学家们开发了一种包含三种具有不一样活性的 CRISPR 系统——CRISPR-AID，该系统由转录激活结构域（CRISPRa）、转录干扰结构域（CRISPRi）和具有催化活性用于删除基因的 CRISPRd 组成，其在试验中将 β-胡萝卜素产量提高了 3 倍。
第四种方法是适应性实验室进化（ALE）。利用萜类代谢物的天然活性响应发出的应激源，增加相关化合物的产量或引入目标性状。
第五种方法是共培养系统。通过酵母和细菌的共培养将萜类化合物的生物合成途径分配在两种微生物中表达，这种代谢途径划分减轻了总代谢负担，可提高酵母中萜类化合物的产量。
萜类化合物由两种通用异构体底物组成并通过模块化途径合成，即异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）。而植物中天然存在两条产生通用萜烯前体 IPP 和 DMAPP 的途径，一是细胞质中的 MVA 途径，这是 FPP 的大多数来自；二是存在于叶绿体中的甲基赤藓糖醇磷酸酯（MEP）途径，这一途径能够协调 GPP 和 GGPP 的合成。
在本综述中，研究人员提到了 3 类重建和调整代谢途径的方法，即调节内源性途径、上游异源途径以及下游异源途径。
第一种方法是调节内源性途径。通过截断和修改酵母同工酶的基因序列片段，提高酶的催化周转率，减少代谢途径的限制。已有研究证明，上调代谢途径中的关键基因与甲羟戊酸途径关键限速酶 HMGR 的稳定性具有协同效应，增强了 MVA 途径的代谢通量以及前体化合物的产量。
第二种方法是调节异源上游途径。该途径的重建可以高效合成萜类化合物前体，尤其是引入具备优秀能力催化特性的异源酶可明显地增加目标途径的代谢通量。
第三种方法是调节异源下游途径。萜类化合物的下游路径由萜类化合物的骨架合成和修饰链两个合成模块组成，重建这一途径则需要确保这两个模块功能性生物合成酶的表达。业内正在通过优化海藻糖磷酸合酶（TPS）和装饰酶链两个方面提高萜类化合物前体的合成。
在基于生物合成方法生成萜类化合物的过程中会涉及到多种复杂的生物催化剂，由此产生多种多样的化学结构。在最新的综述中，研究人员介绍了萜类化合物合成过程中所涵盖的生物合成酶从合理诱变到定向进化的策略，其中蛋白质工程策略已经用于改造这些生物合成酶。
综述中提到的第一种策略是工程化修饰异戊二烯基转移酶。利用蛋白质工程技术修改法尼烯合酶（ERG20p），通过理性设计将 ERG20p 改造为显性失活的 GPP 合成酶 ，从而增加单萜的下游产量。双突变的 ERG20（F96W-N127W）则进一步增加了 GPP 的合成，这种菌株生成的桧烯（注：一种天然双环单萜化合物）产量比基础菌株提高了超 343 倍。ERG20 是下游合成细胞成分包括甾醇类、泛醌类、多萜醇等合成代谢通路的必需基因。
第二种策略是工程化改造萜类合成酶。海藻糖磷酸合酶（TPS）具有可塑性，能够最终靠替换少量氨基酸序列产生新功能或改变原有功能。现阶段，已有团队采用不一样的诱变方法提高萜烯合酶的性能。也有研究表明，单个氨基酸残基开关能确定萜烯合酶中的底物特异性和产物特异性。
第三种策略是工程化修饰细胞色素 P450（CYP450）。细胞色素 P450 是一大类参与代谢的植物酶，通过进化这类酶获得了混杂性（Promiscuity），基于工程化手段能调节这一特性，提高催化性能或修改其底物特异性。
在酵母体内，构建的代谢途径越长，细胞的代谢负担也就越大，甚至有可能引起合成途径和天然代谢路径串扰、途径失调以及产生毒性等。为了减轻在酵母中生产萜类化合物生产的限制，综述中提到了 3 种潜在可行的策略。
第一种策略是酶融合物，酶融合技术是酶重要的改造技术之一。为了更好的提高酵母中萜类化合物的产量，有团队开发出融合异戊烯基转移酶的策略，这类酶在连续步骤中起作用，从而有效合成较大的异戊烯基二磷酸。通过将异戊二烯基转移酶与途径中的下游酶（萜烯合酶）融合，异戊二烯基结构单元能够以更高的速率转化为萜烯骨架。
第二种策略是将酵母细胞器转化为生产萜类化合物的亚细胞区室，这种方法有潜力为基于酵母生产萜类化合物提供独特优势。细胞器结构和代谢功能的差异会使这些区室具有特定细胞环境，最大限度减少毒性，提升底物与酶相互作用和反应性能。这种亚细胞区室分隔也有助于限制异源途径与内源 MVA 途径的重叠，减少对类异戊二烯前体的竞争。
第三种策略是调节酵母细胞内膜对萜类生物合成共定位。内质网（ER）膜是参与植物代谢过程中细胞色素 P450 的天然场所，也是其他生物合成酶实现功能化的场所。论文中提到了领域内通过扩大内质网结构增加异源蛋白表达，以及与 ER 靶向信号肽 CNE1 融合等策略。
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